Pocket LAMP

Detección rápida del SARS-CoV-2

Pocket LAMP: Detección rápida del SARS-CoV-2

El primer paso para abordar una enfermedad es el diagnóstico, y es un problema difícil. El brote de SARS-COV-2 es inusual, ya que un porcentaje tan alto de personas infectadas son asintomáticas y propagan la enfermedad mientras parecen sanas. Incluso para aquellas personas que se enfermarán, COVID-19 no siempre da síntomas confiables durante su aparición. La mejor manera de frenar esta enfermedad sin causar un gran dolor económico es poner en cuarentena solo a las personas con la enfermedad, pero esto requiere una gran cantidad de pruebas.

Los centros de pruebas son costosos de configurar y requieren personal altamente capacitado para ejecutar los dispositivos complejos necesarios para detectar COVID-19. Otra opción es realizar pruebas distribuidas utilizando dispositivos económicos. En áreas del mundo con infraestructura de transporte deficiente, esta podría ser la única opción viable.

Si tuviéramos una manera de realizar un ensayo biofísico que pudiera determinar si COVID-19 estaba presente en una muestra, en un dispositivo que fuera lo suficientemente barato como para llegar a todo el mundo, podríamos tener la oportunidad de frenar la propagación del virus hasta que se desarrolle una vacuna.

Mediante este proyecto podremos detectar un puñado de partículas virales COVID-19 de un hisopo nasal y, sin embargo, ser lo suficientemente fácil y confiable como para ser utilizado por personas no capacitadas en condiciones difíciles.

Este proyecto combina técnicas de vanguardia en Biología Molecular para la detección de COVID-19, con un sistema automatizado de espectroscopia de fluorescencia.

Método: Biología de Fondo

Todos los seres vivos (e incluyamos los virus aquí), como mínimo, necesitan un cuerpo y una forma de reproducirse. Los virus se encuentran en los límites lógicos de lo que podemos considerar "vida" porque en realidad no tienen mucho más cuerpo que una simple capa alrededor de su ADN o ARN. No necesitan comer, dormir o incluso tener metabolismo. Todo lo que necesitan hacer es infectar una célula y, una vez dentro, secuestran la maquinaria molecular de esas células para producir nuevas partículas virales. El 'caparazón' o cápside de un virus COVID-19 está formado por proteínas y está cubierto de proteínas Spike, que ayudan al virus a invadir las células. Este tipo particular de virus es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo, que es diferente de la forma en que almacenamos nuestra propia información molecular, que está codificada en el ADN bicatenario.

Cuando alguien está infectado con COVID-19, sus cuerpos intentan armar una defensa. El sistema inmunológico aprende a reconocer las proteínas extrañas en la cápside viral y desarrolla anticuerpos que pueden unirse y atacar al virus. Pero es una carrera contrarreloj. El sistema inmunológico tiene que aprender, desarrollar y construir anticuerpos contra el virus antes de que el virus se propague y destruya las demasiadas células que infecta. El sistema inmunológico también puede provocar una respuesta excesiva y causar daño en sí mismo.

Para hacer un diagnóstico preciso de esta enfermedad, podemos: 

  • Detectar las proteínas del Virus
  • Detectar el ARN del Virus
  • Detectar los anticuerpos que genera un paciente contra el virus durante el curso de la enfermedad.

Veamos cada una de estas opciones:

Detectar las proteínas virales puede ser muy difícil de hacer de manera confiable, ya que puede haber tan pocas partículas virales en la muestra que es casi imposible de detectar (y realmente imposible de hacer a bajo costo), incluso si el paciente está muy infectado.

La detección de los anticuerpos del paciente es un indicador muy confiable, pero solo funciona bien en la infección. Anteriormente, el paciente aún podría ser muy infeccioso, pero la prueba sería negativa ya que sus cuerpos aún no han desarrollado los anticuerpos necesarios.

La detección de ARN es la mejor opción para la detección temprana, ya que existen métodos confiables para hacer un gran número de copias del ARN viral para que incluso unas pocas partículas virales puedan detectarse de manera confiable.

Antecedentes de la biología molecular

Poder hacer copias de ADN desató la revolución de la biología molecular. La innovación clave fue el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR. Nos permite hacer miles de millones de copias de un fragmento de ADN de forma rápida y económica, lo que nos permite clonar ADN, rastrear a nuestros antepasados ​​y producir organismos modificados genéticamente.

El proceso de PCR es conceptualmente simple: en cada ciclo térmico:

a) Desnaturalizamos: calentamos nuestra muestra tan alto que las dobles hebras de ADN se rompen.
b) Recocido: enfriamos la muestra hasta obtener una pequeña pieza de ADN sintético y se adhiere a un solo soporte. Su par de bases está diseñado para coincidir solo con una secuencia exacta.
c) Alargamiento: una proteína especial llamada "polimerasa" funciona como una nano-máquina, extrayendo nucleótidos del líquido que la rodea y usándolos como bloques de construcción que pueden producir nuevo ADN que se extiende desde el ADN sintético corto, usando la hebra única como un templo, en efecto haciendo una copia. Como la nueva copia puede actuar en sí misma como una plantilla, cada ronda de este ciclo de temperatura duplica el número de copias, ¡y es habitual hacer 30 rondas de este tipo!

La PCR también se puede utilizar para detectar otras enfermedades. ¡Esto se debe a que el proceso de copia del ADN solo funciona si los cebadores coinciden exactamente con el ADN viral! Si conocemos una secuencia de ADN que solo se encuentra en un determinado virus (ese es el trabajo de los científicos), podemos diseñar cebadores muy específicos para amplificar solo el ADN de ese y solo ese virus.

El método de detección más utilizado hasta ahora para el SARS-COV-2 ha sido la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y la RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR). Convierte el ARN en ADN (transcripción inversa), luego usa la PCR para intentar hacer copias de una secuencia específica del virus que podría estar presente en la muestra. Si medimos la amplificación del ADN frente al número de ciclos de PCR, podemos estimar cuánto ARN viral inicial estaba presente en la muestra y así poder estimar el progreso de la enfermedad.

Sin embargo, RT-PCR requiere costosos dispositivos termocicladores que comienzan en el rango de los miles de euros y aumentan enormemente el precio de los dispositivos qRT-PCR.

Para una solución distribuida y barata, esto simplemente no puede funcionar.

En YRISH Technology, usamos otro método, que es mucho más complejo desde el punto de vista biofísico, pero mucho más sencillo de realizar en la práctica. Ese método se llama amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y es una técnica de un solo tubo para la amplificación de ADN. Es una alternativa de bajo costo para detectar ciertas enfermedades, incluido el SARS-COV-2, cuando LAMP se combina con un paso de transcripción inversa para permitir la detección de ARN (RT-LAMP).

LAMP es muy difícil de explicar en diagramas. Básicamente, en lugar de una polimerasa de tipo PCR normal, utilizamos un tipo de polimerasa que tiene 2 propiedades especiales:

  • Tiene actividad de "transcripción inversa" y puede "leer" ARN y "escribir" ADN. Eso significa que puede usar ARN como plantilla para generar cadenas de ADN nuevas y coincidentes.
  • Tiene una actividad de "desplazamiento de hebras". Esto significa que la polimerasa puede "descomprimir" activamente el ADN de doble hebra para acceder a los datos internos, por lo que no tenemos que realizar un paso de desnaturalización a alta temperatura, como con la PCR.

No solo eso, sino que como el proceso requiere 4 o 6 cebadores, en realidad es mucho más específico que la PCR, ¡ya que todas las secciones deben coincidir con el ADN de la plantilla!

¿Cuánto es una 'gran cantidad' de ADN?

¡Estamos hablando de un aumento de aproximadamente 10 mil millones de veces! Pero, ¿cómo detectamos que se produce el ADN? Afortunadamente, existen algunos métodos colorimétricos (¡pruebas que cambian de color!) disponibles, y el más fácil es con un tinte especial llamado calceína. La razón por la que este es un método tan bueno es que podemos rastrear con precisión la cantidad de ADN producido a lo largo del tiempo, ya que es directamente proporcional a la fluorescencia producida. Eso significa que, como RT-PCR, podemos rastrear la progresión de la reacción y determinar cuántos virus había en la muestra original.

¿Cómo actúa la calceína como reactivo colorimétrico? Nuestra mezcla de reacción contiene DNTP, o las subunidades de pares de bases individuales que se utilizarán para hacer crecer las cadenas de ADN recién formadas. Cada "letra" tiene tres fosfatos de tierra adheridos a ella, que actúa como el suministro de energía para impulsar la reacción. Uno de los fosfatos forma la "columna vertebral" de cada hebra de ADN, y los otros dos se desechan.

En nuestra mezcla de reacción hay dos tipos de iones metálicos Magnesio y Manganeso. El tinte de calceína se apaga con manganeso (lo que significa que el ión metálico se adhiere y estropea la capacidad de fluorescencia de la calceína). A medida que avanza la reacción, esos pirofosfatos "de desecho" se acumulan y los iones de manganeso prefieren adherirse al pirofosfato que a la calceína. Esto significa que la calceína ahora comienza a formar complejos de calceína-magnesio, que son visibles como fluorescencia verde brillante cuando están bajo luz azul o ultravioleta.

Aunque a veces se puede ver la calceína activada a simple vista sin rayos ultravioleta, es mejor seguir con precisión la cantidad de fluorescencia. Esto se debe a que, como la RT-PCR descrita anteriormente, si hacemos un seguimiento cuando vemos aparecer la fluorescencia por primera vez, ¡podemos calcular cuántas partículas virales había en la muestra original!

Al final, si hay partículas virales en la muestra, la creación exponencial de ADN consumirá todos los DNTP y cada molécula de calceína se volverá fluorescente. Cuantas más partículas virales haya, antes se podrá medir.

Para realizar una prueba de COVID-19, solo se necesita mezclar los materiales descritos anteriormente en un tubo de PCR.

CONCLUSIONES

La crisis del COVID-19 necesita nuevos modelos para llevar las pruebas y los medicamentos al mundo entero. Uno de esos modelos es un sistema distribuido, donde los dispositivos y la tecnología baratos se extienden a donde se necesitan.

Nunca será tan rentable como un enfoque centralizado, con máquinas de prueba a escala industrial funcionando 24 horas al día, 7 días a la semana. Pero, en países donde no hay grandes cantidades de capital para invertir en equipo y personal costosos, o la infraestructura de transporte del país simplemente no puede llevar muestras a un punto centralizado de manera rápida o eficiente, un sistema distribuido podría ser la única forma.

La tecnología de laboratorio para las pruebas de COVID-19 se ha desarrollado sorprendentemente rápido en los últimos meses. Esa tecnología debe integrarse en sistemas que puedan salir del laboratorio y llegar a las manos de personas de todo el mundo. Espero que este proyecto haya demostrado que incluso la tecnología más avanzada a veces se puede poner en nuestras manos.

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